引言
纳米技术的发展为克服耐药性危机提供了机会。纳米粒子具有多功能特性，如尺寸小、易修饰、比表面积大和生物相容性好，被广泛应用于纳米粒子抗菌剂的研究[3]。与抗生素相比，纳米粒子抗菌剂不仅具有更低的毒性、更低廉的成本和更好的抗菌效果，同时有助于解决细菌耐药性的问题[4]。纳米粒子抗菌剂可以作用于细菌多靶点，而细菌很难同时产生多点基因突变对其产生抗性[5]。目前，纳米粒子抗菌剂主要通过两方面发挥作用：一是利用纳米粒子作为递送抗菌药物的载体，二是利用纳米粒子本身的抗菌性能抗菌[6]。可以通过物理封装、吸附或化学偶联作用将抗菌药物负载到纳米粒子[7]，例如利用脂质体[8]、聚合物纳米粒子[9-10]、固体脂质纳米粒子[11-12]和树枝状聚合物纳米粒子[13-14]等载体将抗菌药物输送到感染部位，与游离药物相比，利用纳米粒子递送抗菌药物不仅能改变抗菌药物的药代动力学特性，提高疏水性药物的溶解度，而且还可以延长药物的半衰期，减少给药频率，降低药物的毒副作用[15]。Hu等[16]通过Sonogashira偶联反应将SiO2纳米粒子与三氯异氰尿酸、乙炔基苯结合，脱除SiO2模板后在其表面修饰Fe3O4，合成了新型磁性共轭微孔聚合物空心球(CMP-HSs@Fe3O4)，该聚合物空心球的比表面积高、孔体积大，使得抗生素分子易透过CMP-HSs壁并被大量吸附在球体腔中，吸附大量抗生素的CMP-HSs@Fe3O4具有抗菌性能高、易于分离回收等优点。但是，利用复合纳米粒子负载抗生素抗菌依然存在细菌耐药性的问题。除了作为抗菌药物的载体外，纳米粒子由于其本身的抗菌性能而广泛用作纳米粒子抗菌剂，例如某些金属和金属氧化物纳米粒子[5]、碳基纳米材料[17]、阳离子肽[18]、阳离子聚合物[19]及壳聚糖[20]等纳米材料。纳米粒子的抗菌机理主要有两种：一种是破坏细菌的细胞膜电位，导致运输失衡、呼吸受损、能量传导中断或细胞裂解[21]；另一种是通过纳米粒子本身接触或破坏呼吸链间接诱发产生活性氧(ROS)[22]，ROS爆发会导致脂质过氧化、蛋白质氧化损伤、酶抑制、RNA和DNA损伤和突变，从而导致细菌死亡[23-24]。Kim等[25]利用TiO2纳米粒子与芳香族聚酰胺薄膜层羧基官能团的配位和氢键作用，自组装制备了杂化薄膜复合(TFC)膜，TFC膜上的TiO2在紫外线照射下经过光催化形成活性氧，破坏大肠杆菌(E.coli)生物膜的形成，从而抑制细菌在TFC膜表面的附着。Liu等[26]设计了一种短的两亲肽-胆固醇偶联物(CG3R6TAT)并自组装成阳离子纳米粒子，与细胞穿膜肽(TAT)相比，阳离子纳米粒子增大了阳离子的电荷密度，增强了与表面带负电荷细菌的静电作用，使其抗菌性能提高。
本文采用溶剂热法合成了分散性良好的Fe3O4纳米粒子，经油酸(OA)修饰后，通过疏水作用包覆季铵盐类抗菌剂十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，制得Fe3O4@CTAC粒子。Fe3O4@CTAC粒子可以通过静电作用吸附在菌体表面，改变细胞膜的通透性，导致细胞内容物释放，细胞失活。Fe3O4@CTAC粒子不仅具有抗菌作用，还可以通过磁场分离去除菌体。目前，尚未见CTAC修饰磁性粒子作为抗菌剂的文献报道。
1 实验部分
1.1 实验材料和仪器
1.1.1 实验材料
六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O，分析纯)、乙二醇(分析纯)、OA(分析纯)、异硫氰酸荧光素(FITC，纯度90%)、无水乙酸钠(NaAc，纯度99%)、CTAC(纯度97%)、琼脂粉(生物试剂)，上海麦克林生化科技有限公司；聚乙二醇4000(PEG-4000，化学纯)、氯化钠(NaCl，分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇(分析纯)，天津市富宇精细化工有限公司；蛋白胨(生物试剂)、酵母浸粉(生物试剂)，北京奥博星生物技术有限责任公司；大肠杆菌(E. coli Nissle1917)、金黄色葡萄球菌(S. aureus ATCC6538)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis ATCC9372)为本实验室保藏；LB固体培养基，含5 g/L酵母浸粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，1.5%琼脂粉，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。
1.1.2 实验仪器
SUPRA-55型扫描电子显微镜(SEM)，德国ZEISS公司；ESCALAB 250型X射线光电子能谱仪(XPS)，美国THERMO VG公司；Ultima-Ⅲ型X射线衍射仪(XRD)，日本理学公司；PALS型Zeta电位分析仪，美国布鲁克海文仪器公司；7404型振动样品磁强计(VSM)，美国Lake Shore公司；ZQLY-180E型振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；DM1000型荧光显微镜，德国Leica公司。
1.2 实验方法
1.2.1 Fe3O4@CTAC粒子的制备
首先，按照文献[37]的方法制备Fe3O4粒子。称取2.7 g FeCl3·6H2O于80 mL乙二醇中，经磁力搅拌至完全溶解，加入7.2 g NaAc和2.0 g PEG-4000，继续磁力搅拌混匀。将混匀后的溶液转移到聚四氟乙烯衬底的高压反应釜中，于200 ℃反应8 h。反应结束后，将磁性响应物质用去离子水和无水乙醇反复洗涤数次，在60 ℃的真空干燥箱中过夜，得到Fe3O4粒子。
称取1.0 g Fe3O4粒子于250 mL圆底烧瓶中，加入40 mL无水乙醇，超声20 min，加入260 μL OA，在80 ℃、300 r/min的条件下磁力搅拌6 h，将反应产物用去离子水和无水乙醇反复洗涤数次，得到OA修饰的Fe3O4粒子(Fe3O4@OA粒子)。将获得的所有Fe3O4@ OA粒子加入圆底烧瓶中，加入20 mL去离子水、20 mL无水乙醇和1.0 g CTAC，在室温、400 r/min的条件下磁力搅拌1 h，将得到的反应产物用去离子水洗涤数次，于60 ℃真空干燥过夜，得到CTAC包覆的Fe3O4粒子，即Fe3O4@CTAC粒子，于4 ℃保存。
1.2.2 Fe3O4@CTAC粒子的表征
采用SEM观察样品的微观形貌及粒径均匀性，并通过能谱(EDS)进行元素分析；采用XPS检测样品的元素组成；采用XRD检测样品的晶体结构：铜靶，波长0.154 056 nm，扫描速度10(°)/min，扫描范围10°~80°；采用Zeta电位分析仪检测样品的表面电荷；采用VSM检测样品的磁性。
1.2.3 Fe3O4、Fe3O4@OA和Fe3O4@CTAC的抗菌性能测定
将Fe3O4、Fe3O4@OA和Fe3O4@CTAC粒子分别分散在0.9%的生理盐水(pH=6.8)中，得到10 mg/mL悬液。将E. coli进行液体培养，使用分光光度计在600 nm波长下检测菌液的光密度值(OD600)，当OD600=0.5时，将其稀释3倍至菌浓度为105 cfu/mL。分别取上述1 mL悬液与1 mL E. coli菌液，于37 ℃、180 r/min的条件下反应10 min。反应结束后，吸取100 μL反应液涂布于LB固体培养基平板，培养过夜，记录E. coli的菌落数，按照下式计算抗菌率R。
式中：N0为反应前E. coli菌液(105 cfu/mL)中E. coli的菌落数，N1为反应结束后反应液中E. coli的菌落数。
1.2.4 不同Fe3O4@CTAC粒子含量及作用时间下抗菌效果测试
分别取1 mL不同含量的Fe3O4@CTAC悬液(5、10、25、50 mg/mL)与1 mL E. coli菌液(105 cfu/mL)，于37 ℃、180 r/min的条件下反应不同时间(10、20、30、40、50、60 min)，反应结束后，吸取100 μL反应液涂布于LB固体培养基平板，培养过夜，记录菌落数并计算抗菌率，绘制不同Fe3O4@CTAC粒子含量下抗菌率随作用时间的变化曲线。
1.2.5 Fe3O4@CTAC对E. coli、S. aureus及B. subtilis的抗菌性能测试
分别取1 mL的E. coli、S. aureus及B. subtilis菌液(105 cfu/mL)与1 mL Fe3O4@CTAC悬液(50 mg/mL)，于37 ℃、180 r/min的条件下反应10 min，反应结束后，吸取100 μL反应液涂布于LB固体培养基平板，培养过夜，记录菌落数并计算抗菌率。
1.2.6 Fe3O4@CTAC粒子对菌体的去除
取1 mL Fe3O4@CTAC悬液(50 mg/mL)与1 mL E.coli菌液(105 cfu/mL)混合，在37 ℃、180 r/min的条件下反应10 min。反应结束后对反应体系进行磁分离，向获得的磁响应固体物质、剩余溶液和对照(1 mL Fe3O4@CTAC悬液与1 mL生理盐水)中分别加入0.1 mg FITC，在4 ℃冰箱中在黑暗条件下染色13 h。染色结束后，通过离心法弃去上清液以除去多余的FITC。于9 250 g离心3 min后用生理盐水洗涤，再重复离心，7次循环后，采用荧光显微镜在495 nm的激发波长下观察荧光染色结果。
2 结果与讨论
2.1 Fe3O4@CTAC粒子的表征结果
2.1.1 微观形貌
2.1.2 元素组成
2.1.3 晶体结构
通过XRD表征了Fe3O4及Fe3O4@CTAC的相组成和结构，如图 3 所示。可以看出，Fe3O4和Fe3O4@CTAC均在2θ为18°、30°、36°、43°、53°、57°、63°和74°处出现衍射峰，并且这些衍射峰的位置与Fe3O4标准卡片(JCPDS card，No.19-0629)衍射峰的位置一致，表明合成的Fe3O4为反尖晶石结构，并且Fe3O4@CTAC的晶体结构与Fe3O4一致，表明OA和CTAC的修饰不会引起Fe3O4的相变。
2.1.4 Zeta电位
通过Zeta电位表征了Fe3O4及Fe3O4@CTAC粒子在不同pH下的稳定性，如图 4 所示。结果表明，与Fe3O4粒子相比，CTAC包覆后Fe3O4@CTAC粒子表面的正电荷增多，Zeta电位升高，等电点右移。在pH=6.8时，Fe3O4@CTAC的Zeta电位绝对值高于30 mV，证明Fe3O4@CTAC粒子分散体系的稳定性良好。
2.1.5 磁性
2.2 Fe3O4@CTAC粒子的抗菌性能及菌体去除效果
2.2.1 Fe3O4、Fe3O4@OA和Fe3O4@CTAC粒子的抗菌性能比较
2.2.2 Fe3O4@CTAC粒子含量及作用时间对抗菌率的影响
2.2.3 Fe3O4@CTAC粒子对E. coli、S. aureus和B. subtilis的抗菌性能
2.2.4 Fe3O4@CTAC粒子对菌体的去除效果
采用FITC染色法，通过荧光显微镜观察Fe3O4@ CTAC粒子对E. coli菌体的去除效果，如图 9 所示。结果显示，磁响应固体部分(图 9(a) )观察到绿色荧光，而磁分离后的剩余溶液(图 9(b) )及对照(图 9(c) )未观察到绿色荧光，这表明E. coli菌体可以与Fe3O4@CTAC粒子结合并通过磁场分离从反应体系中去除，从而实现高效抗菌及无菌体残留。
3 结论
采用溶剂热法合成了分散性良好的Fe3O4粒子，然后将OA修饰到Fe3O4粒子表面，再通过疏水作用进行CTAC包覆，成功制得Fe3O4@CTAC粒子，并对其进行了表征分析、抗菌性能及磁分离去除菌体测试，所得结论如下：
(1) 在Fe3O4粒子表面修饰OA以及进行CTAC包覆后，Fe3O4@CTAC粒子的粒径无明显变化，并且仍保持良好的单分散性；Fe3O4@CTAC与Fe3O4粒子均为反尖晶石结构；与Fe3O4粒子相比，Fe3O4@ CTAC粒子的饱和磁化强度略有下降，但依然保持超顺磁性和良好的磁响应性能；Zeta电位分析结果表明本文制备的Fe3O4@CTAC粒子具有较高的稳定性。
(2) Fe3O4@CTAC粒子(50 mg/mL)与E. coli菌液(105 cfu/mL)反应10 min，抗菌率即可达到100%；Fe3O4@CTAC粒子对E. coli、S. aureus及B. subtilis均具有良好的抗菌效果；通过磁场分离作用可以将Fe3O4@CTAC粒子及吸附的菌体去除，实现无菌体残留。以上结果表明Fe3O4@CTAC粒子是一种快速、高效并且可以实现无菌体残留的抗菌剂，具有潜在的应用前景。