2. 深圳市中医院, 深圳 518000
2. Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518000, China
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F)系卫矛科植物，主要产自浙江、江苏等地。雷公藤作为一种传统中药材，始记于《神农本草经》[1]，其性凉味辛，归肝、肾经，具有免疫调节和抗炎作用[2]，是临床上首选的中药免疫抑制剂。然而雷公藤的治疗剂量接近中毒剂量[1]，极大地限制了在临床上的广泛应用。因此，雷公藤的减毒持效研究成为近年关注的焦点。雷公藤的主要化学成分为生物碱类、萜类，其中，生物碱类主要成分有雷公藤春碱、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤定碱；二萜类主要成分有雷公藤甲素、雷酚内酯；三萜类主要成分有雷公藤红素、雷公藤内酯甲。它们既是雷公藤的主要药效成分，同时也是减毒持效的主要监测对象。
双向固体发酵技术(bidirectional solid fermentation)是以药用真菌发酵药性基质的一种技术[3]，产物药性菌质常表现出高于真菌和药性基质相加的药效[2-4]，该技术具有增效、解毒、扩大药用范围等显著优势。灵芝(Ganoderma lucidum Karst)是多孔菌科真菌，同时也是药理活性优良的药材。在双向固体发酵中，灵芝作为发酵菌种已经得到许多应用，例如可以明显增强草乌的抗炎镇痛作用[5]，有助于附片的解毒增效[6]，对于中药的毒性和药效有很好的改善作用。作为发酵中药的常用菌种，灵芝也是发酵雷公藤的良好选择，其产物命名为灵雷菌质。庄毅等[7]建立了灵芝双向固体发酵雷公藤的工艺，发现发酵30天得到的灵雷菌质相比于雷公藤生药表现出了减毒持效的作用。侯志帆等[8]检测了雷公藤发酵前后的成分变化，结果表明双向固体发酵可以降低雷公藤中有毒化合物的含量。以上研究仅检测了小鼠给药后的死亡情况和淋巴细胞的增殖情况，并且仅进行了液相色谱检测，辨认出雷公藤甲素和邻苯二甲酸酯类成分含量的下降。而灵雷菌质对于炎症因子释放的影响还未见报道，对于人正常肝细胞的体外毒性还未经检验，并且雷公藤的主要成分在双向固体发酵中的变化也没有监测。
研究表明，雷公藤的抗炎作用与机体细胞因子的调节有关，现有成药雷公藤多苷(tripterygium glycosides)主要通过影响toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信号通路，拮抗和抑制炎症因子的释放，包括人肿瘤坏死因子TNF-α[9]、人白细胞介素IL-1β和IL-6[10-11]等，从而发挥抗炎作用[12-13]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以识别并激活TLR4，常用于启动炎症反应。巨噬细胞通常处于基态，活化后可向促炎的M1和免疫抑制的M2两种表型进行转化[14]。巨噬细胞受LPS刺激后，活化成M1表型，分泌TNF-α、IL-6等M1型标志物以及一氧化氮合酶iNOS等炎症因子，可以用作药物抗炎的研究模型[15]。
体外研究表明，雷公藤甲素可以通过启动肝细胞氧化应激而导致肝损伤。在人正常肝细胞L02中，雷公藤甲素(处理浓度60~180 nmol/L，处理时间12~48 h)表现出时间和剂量依赖的细胞毒性[16]，通过引发人正常肝细胞L02活性氧水平升高[17]、线粒体膜电位去极化，从而诱导间质细胞凋亡。动物实验也显示，肝脏是雷公藤毒性损伤的易感靶器官之一[18]。雷公藤肝毒性与功效密切相关，高剂量的雷公藤可使肝脏形成实质性损伤甚至坏死[19]。
本文以灵芝为药用真菌，采用双向固体发酵技术发酵药性基质雷公藤，得到发酵30天和40天的产物灵雷菌质，比较它们对LPS诱导的M1型巨噬细胞释放炎症因子以及对人正常肝细胞增殖的影响，并使用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法分析了雷公藤在发酵前后的成分变化。
1 实验部分 1.1 实验材料和仪器 1.1.1 实验材料雷公藤购自上海源叶生物科技有限公司，灵芝菌种购自中国微生物菌种保藏管理中心，小鼠RAW264.7细胞系购自江苏凯基生物技术股份有限公司，人正常肝细胞L02细胞系购自北纳创联生物科技有限公司，TNF-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒和IL-6 ELISA试剂盒购自默沙克生物技术有限公司，LPS和CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，高糖DMEM培养基和RPMI-1640培养基购自北京沃卡威生物技术有限公司，雷公藤甲素、雷公藤红素、雷酚内酯标准品购自上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯，购自北京奥博星生物技术有限公司。
1.1.2 仪器超净工作台(SW-CJ-1D型，苏州净化设备有限公司)，细胞培养箱(311型，Thermo Fisher公司)，恒温恒湿培养箱(LHC-150型，北京陆希科技有限公司)，高压灭菌锅(BKQ-B50Ⅱ型，山东博科生物产业有限公司)，电子天平(BSA224S型，Sartorius公司)，酶标仪(K3Plus型，上海宝予德科学仪器有限公司)，离心机(Heraeus Pico 17型，Thermo Fisher公司)，恒温干燥箱(DGG-9070A型，上海森信实验仪器有限公司)，超高效液相色谱四级杆飞行时间串联质谱仪(XEVO-G2QTOF#YCA121型，Waters公司)。
1.2 双向固体发酵在无菌条件下从灵芝母种斜面上切取0.5 cm3菌块，转接到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基上，置于28 ℃、相对湿度60%的条件下培养6天进行活化[20-21]。在无菌条件下从活化的灵芝斜面上切取3~4块1 cm3菌块，接入装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，置于28 ℃且避光的条件下以120 r/min培养6天，挑选液体澄清、菌球大小均匀的液体种子作为发酵菌种。液体种子培养基配方：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.75 g/L，CaCO3 2.5 g/L，VB1 0.1 g/L。
将雷公藤于55 ℃干燥粉碎，过五号筛(筛孔尺寸为0.177 mm)后用量筒量取粉末，以100 mL/瓶的量加入到250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min后均匀接种灵芝菌种，接种量分别为7 mL/100 mL(命名为N1组)和10 mL/100 mL(命名为N2组)，每组设置3个平行对照。置于27 ℃[22]、相对湿度60%且避光的条件下培养，定期补充一定水分，每天观察灵芝的生长情况并拍照记录全瓶期、旺盛度等。在发酵的第30天和第40天，从N1组和N2组中收集灵雷菌质，于55 ℃干燥粉碎，所得灵雷菌质粉末分别标记为N1-G30(N1组发酵30天)、N2-G30(N2组发酵30天)、N1-G40(N1组发酵40天)、N2-G40(N2组发酵40天)。固态发酵培养基中仅含雷公藤中药基质。
精密称取灵雷菌质及雷公藤粉末0.2 g，置于2 mL无菌管中进行提取，加入无水甲醇1.5 mL，于30 ℃、500 W超声提取1 h，冷却至室温，以12 000 r/min离心10 min，分离得到上清液。随机取样10组，每组样本重复提取3次。混合每组上清液，经过0.22 μm微孔滤膜后，将一部分滤液直接用于成分检测，另一部分继续冻干，然后精密称取0.1 mg重新溶解于1 mL超纯水中，于121 ℃灭菌20 min，然后稀释成不同浓度用于细胞试药。
1.3 细胞培养小鼠RAW264.7细胞置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养，以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养基为完全培养基，传代周期为2~3天，选取对数生长期细胞进行试验。
人正常肝细胞L02置于37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养，以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基为完全培养基，传代周期为2~3天，选取对数生长期细胞进行试验。
1.4 ELISA试验通过ELISA试验检测灵雷菌质对小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6的影响。小鼠RAW264.7细胞以每孔10 000个/100 μL接种于96孔板，LPS处理的质量浓度为1 μg/mL，雷公藤、灵雷菌质处理的质量浓度为3.75 μg/mL。设置对照组(加入LPS但未加样品(雷公藤、灵雷菌质))，试验组(加入LPS和样品)。将各组置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养48 h，离心后仔细收集上清，使用ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6的相对含量。
1.5 CCK-8试验通过CCK-8试验检测灵雷菌质对人正常肝细胞L02增殖的影响。人正常肝细胞L02以每孔10 000个/100 μL接种于96孔板，雷公藤和灵雷菌质处理的质量浓度为1.88、3.75、7.5 μg/mL。设置对照组(有细胞但未加样品(雷公藤、灵雷菌质))，试验组(有细胞且加入样品)。使用CCK-8试剂盒测定细胞吸光度值，按照式(1)计算细胞活力。
| $ C=\frac{A_{\mathrm{c}}-A_{0}}{A_{\mathrm{b}}-A_{0}} \times 100 \% $ | (1) |
式中，C为细胞活力，Ac为试验组吸光度值，Ab为对照组吸光度值，A0为背景吸光度值。
1.6 LC-MS测试通过LC-MS对比雷公藤和灵雷菌质的成分差异[23-24]。将样品适当稀释后进行检测。色谱运行条件：以水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速0.2 mL/min，柱温45 ℃，进样量5 μL。质谱运行条件：ESI+，扫描质量范围为质荷比m/z 50~1 500，毛细管电压3 000 V，检测器电压3 000 V，步长5 spectra/s。运用MassLynx V4.1软件处理分析数据，采用Elemental composition计算m/z对应的分子式，推测相关成分。结果具有高分辨率，对于m/z 956，分辨率≥ 20 000半高全宽(FWHM)，且不损失灵敏度；对于m/z 152.071 2，分辨率≥10 000 FWHM，且不损失灵敏度。分析时调用4位的m/z。
1.7 统计学分析实验数据采用Origin统计软件(2018版)进行分析，样本均数的比较采用完全随机设计的单因素方差分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。重复数n=3，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与讨论 2.1 雷公藤双向型固体发酵过程观察雷公藤接种灵芝进行双向固体发酵，在发酵过程中密切观察N1组和N2组锥形瓶中灵芝的生长状况，并拍照记录，结果如图 1所示。发酵第8天，N2组开始出现灵芝菌丝；发酵第14天，N1组开始出现灵芝菌丝；发酵第17天，N2组中灵芝已基本长满全瓶；发酵第22天，N1组中灵芝已长至半瓶，N2组已完全长满全瓶；发酵第25天，N1组中灵芝已基本长满全瓶；发酵第30天，N1组中灵芝已完全长满全瓶，N2组中部分灵芝成柱状生长；发酵第40天，N1组中出现柱状灵芝，N2组中柱状灵芝生长迅速。结果表明，在7 mL/100 mL和10 mL/100 mL的接种量下，30天可以使灵芝对雷公藤进行充分发酵，并且接种量较多的灵芝生长更快。
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图 1 N1组和N2组中灵芝的生长状况 Fig.1 Growth status of Ganoderma lucidum in N1 and N2 groups |
图 2为不同样品对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响。由图 2(a)可知，N1-G30和N2-G30组的TNF-α相对含量均低于雷公藤组。N1-G30组的TNF-α相对含量为0.236，与雷公藤组相比降低了22.37%(P < 0.01)；N2-G30组的TNF-α相对含量为0.274，与雷公藤组相比降低了9.87%(P < 0.05)。由图 2(b)可知，N1-G40和N2-G40组的TNF-α相对含量与雷公藤组没有显著差异(P>0.05)。
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*P＜0.05，**P＜0.01，n.s.表示P＞0.05，下同。 图 2 不同样品对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响 Fig.2 Effects of different samples on the content of TNF-α released from RAW264.7 cells induced by LPS |
图 3为不同样品对LPS诱导RAW264.7细胞释放IL-6的影响。由图 3(a)可知，仅N2-G30组的IL-6相对含量低于雷公藤组，N2-G30组的IL-6相对含量为0.220，与雷公藤组相比降低了19.12%(P < 0.05)。由图 3(b)可知，N1-G40和N2-G40组的IL-6相对含量均低于雷公藤组。N1-G40组的IL-6相对含量为0.567，与雷公藤组相比降低了15.5%(P < 0.05)；N2-G40组的IL-6相对含量为0.451，与雷公藤相比降低了32.79%(P < 0.01)。
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图 3 不同样品对LPS诱导RAW264.7细胞释放IL-6的影响 Fig.3 Effects of different samples on the content of IL-6 released from RAW264.7 cells induced by LPS |
综合以上结果可知，在3.75 μg/mL的质量浓度下，对于LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用，N1-G30、N2-G30组强于雷公藤组；对于LPS诱导的RAW264.7细胞释放IL-6的抑制作用，N2-G30、N1-G40、N2-G40组强于雷公藤组。虽然各雷公藤组与对照组相比没有抑制炎症因子的释放，但是文献中已有雷公藤在体外抑制炎症因子的报道[25]，可能是因为醇提取的条件、试验的质量浓度无法表现出雷公藤的抗炎活性。灵雷菌质的醇提取物中，只有N2-G30对小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6同时有抑制作用，表现出的抗炎活性有较好的提升。因此，本文进一步探索N2-G30的醇提取物对人正常肝细胞L02增殖的影响。
2.3 灵雷菌质的肝毒性评价图 4为不同质量浓度下雷公藤和N2-G30对人正常肝细胞L02增殖的影响。由结果可知，在1.88 μg/mL的质量浓度下，N2-G30组的细胞活力为51.6%，与雷公藤组相比提高了8.48%(P < 0.05)。在3.75 μg/mL的质量浓度下，N2-G30组的细胞活力为43.76%，与雷公藤组相比提高了14.04%(P < 0.05)。在7.5 μg/mL的质量浓度下，N2-G30组的细胞活力与雷公藤组没有显著差异(P>0.05)。结果表明，与其他质量浓度相比，3.75 μg/mL的N2-G30表现出更好的减毒效果。
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图 4 不同质量浓度下不同样品对L02细胞增殖的影响 Fig.4 Effect of different samples at different mass concentrations on the cell viability of L02 cells |
为了进一步探究雷公藤和N2-G30醇提取物的成分差异，选取雷公藤甲素、雷公藤红素、雷酚内酯标准品作为对照进行LC-MS测试，结果如图 5所示。发酵前后的样品在不同保留时间tR处的色谱峰出现了强度不一致的情况，表明灵芝双向固体发酵使雷公藤的成分产生了明显的变化。
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图 5 雷公藤发酵前后的基峰离子色谱图 Fig.5 Ion chromatograms of basic peaks before and after fermentation of Tripterygium wilfordii |
图 6为雷公藤甲素的质谱峰，未提取到色谱峰进行面积积分。雷公藤发酵前后都检测到雷公藤甲素的存在，标准品、雷公藤发酵前、发酵后雷公藤甲素的准分子离子峰分别为m/z 361.165 5[M+H]+、m/z 361.164 6[M+H]+、m/z 361.164 7[M+H]+。雷公藤发酵后的峰强度由发酵前的18 950增加到40 804，表明雷公藤甲素的含量增加，这与雷公藤抗炎活性的维持有关。
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每个峰的第一行数字表示峰强度，第二行数字表示质荷比，下同。 图 6 雷公藤甲素的质谱峰 Fig.6 Mass spectra peaks of triptolide |
图 7和图 8分别为雷公藤红素的质谱峰和色谱峰。雷公藤发酵前后都检测到雷公藤红素的存在，标准品、雷公藤发酵前、发酵后雷公藤红素的准分子离子峰分别为m/z 451.284 7[M+H]+、m/z 451.283 8[M+H]+、m/z 451.284 9[M+H]+。发酵后雷公藤红素的质谱峰强度由发酵前的120 793增加到622 700，色谱峰面积积分由发酵前的121增加到1 023，均表明雷公藤红素的含量增加，这与雷公藤抗炎活性的维持有关。
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图 7 雷公藤红素的质谱峰 Fig.7 Mass spectra peaks of celastrol |
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每个峰的第一行数字表示保留时间，第二行数字表示面积积分。 图 8 雷公藤红素的色谱图 Fig.8 Chromatograms of celastrol |
图 9为雷酚内酯的质谱峰，未提取到色谱峰进行面积积分。雷公藤发酵前后都检测到雷酚内酯的存在，标准品、雷公藤发酵前、发酵后雷酚内酯的准分子离子峰分别为m/z 313.180 3[M+H]+、m/z 313.180 3[M+H]+、m/z 313.179 8[M+H]+。发酵后的峰强度由发酵前的21 816增加到158 216，表明雷酚内酯的含量增加，这与雷公藤抗炎活性的维持有关。
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图 9 雷酚内酯的质谱峰 Fig.9 Mass spectra peaks of triptophenolide |
通过m/z查找雷公藤春碱、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤定碱、雷公藤内酯甲的疑似峰，计算并推测其分子式，结果只得到雷公藤内酯甲，其[M+H]+对应的分子式为C30H47O3。图 10为雷公藤内酯甲的质谱峰，未提取到色谱峰进行面积积分。发酵前、发酵后雷公藤内酯甲的准分子离子峰分别为m/z 455.351 0[M+H]+、m/z 455.350 0[M+H]+，并且都存在丢失中性H2O分子的特征峰m/z 437.340 3[M+H-H2O]+，进一步丢失—CH3碎片形成m/z 422.327 9[M+H-H2O-CH3]+及m/z 422.348 7[M+H-H2O-CH3]+。发酵后的准分子离子峰的峰强度由发酵前的184 028降低至123 972，表明雷公藤内酯甲的含量减少[26]，这与雷公藤的减毒作用直接相关。
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图 10 雷公藤内酯甲的质谱峰 Fig.10 Mass spectra peaks of wilforlide A |
N2-G30的质量浓度为3.75 μg/mL时，对小鼠RAW264.7细胞在脂多糖诱导下释放两种促炎因子TNF-α和IL-6都有抑制作用，并且对人正常肝细胞L02的增殖毒性较小。N2-G30中，雷公藤甲素、雷公藤红素、雷酚内酯含量的增加与雷公藤抗炎活性的维持有关，而雷公藤内酯甲含量的减少与雷公藤的减毒作用直接相关。说明灵芝双向固体发酵(接种量10 mL/100 mL，发酵时间30天)能够通过成分的变化影响雷公藤的活性与毒性，从而促进其减毒持效作用的产生。灵芝双向固体发酵技术在中药减毒持效上的应用是值得重视的，今后应在协调好雷公藤“量-效-毒”关系的基础上，不断改进双向发酵技术，从而在根本上降低雷公藤的毒性，真正实现安全有效地用药。
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